如何從樣品預處理角度，提高支原體檢測的準確性

支原體放行檢測，在臨床相關的項目中發揮著重要作用。常見的一些研究，如干細胞治療項目、免疫細胞治療項目研究、CAR-T項目研究、抗體藥研究、疫苗等領域，以及還有一些重要的細胞培養、細胞典藏項目，都需要對培養的細胞或收獲的產物，進行準確度較高的支原體檢測，以保證產物沒有支原體污染。?

qPCR法是十分常用的支原體檢測方法。藥典中指出，通過方法學驗證，即在檢測限、特異性和耐用性等方面達到要求后，才能替代傳統的檢查方法。因此，qPCR實驗的結果的穩定性與精準度，直接關系到方法學驗證是否可信。

除了實驗操作、所選擇的試劑盒等常見的影響因素，待檢樣品的預處理方法，也會對qPCR檢測結果造成不同程度的影響。

用于支原體檢測的樣品的成分通常比較復雜，可能存在抑制PCR的物質，影響qPCR實驗的結果。在進行qPCR檢測之前，需要將樣品中的支原體DNA純化出來，以確保檢測的準確性和靈敏度。

進行DNA提取的優勢：

1、提高檢測的準確性：DNA提取可以有效地從復雜樣品中分離出支原體的DNA，避免雜質對檢測結果的干擾，從而提高檢測的準確性，降低假陽性結果的可能性。

2、增加檢測的靈敏度：通過DNA提取，可以將支原體的DNA濃縮到較高的水平，使其在qPCR中的檢測限度更低，提高了檢測的靈敏度，即能夠檢測到更低濃度的支原體。

3、節省成本：雖然DNA提取可能需要一定的時間和成本，但它可以避免由于假陽性結果而帶來的額外成本，如錯誤的結果導致方法學驗證失敗等。

因此，當待檢樣品如果存在以下幾種情況（包括但不限于），需要對樣品進行DNA提取處理，以提高支原體檢測的靈敏度：

1、細胞培養基中的血清濃度如果超過12%，那么對下游的PCR反應會產生抑制。酚紅，對熒光定量PCR的檢測也會干擾。這些均可以通過使用德國Miverva Biolabs公司的支原體DNA提取試劑盒來解決。

2、對于樣品類型是細胞團、疫苗、凍存細胞和石蠟包埋的組織，需要提前提取DNA。

3、如果樣品中蛋白含量高于10mg/ml，則先需要用蛋白酶K進行處理，再用原體DNA提取試劑盒提取樣品中的DNA。

德國Minerva Biolabs公司生產的Venor®GeM Sample preparation Kit支原體DNA提取試劑盒，可實現支原體檢測方法驗證過程中的樣品制備步驟，包括DNA提取和純化，可防止可能干擾qPCR擴增的污染物或抑制劑的引入。從細胞上清和生物制品中分離支原體DNA，全程只需30分鐘。該試劑盒的操作分四步：細胞溶解，DNA特異性與層析柱結合，祛除殘留的污染物和抑制劑，洗脫DNA。

該試劑盒符合歐洲藥典規范，配合支原體qPCR檢測試劑盒、支原體標準品一起使用，通過歐洲藥典的方法學驗證，助力新藥上市。